Imaging super-risoluzione 3D con soTILT3D: un salto in avanti nella microscopia cellulare

Nel campo della microscopia moderna, una delle maggiori sfide è quella di ottenere una visualizzazione dettagliata delle strutture subcellulari complesse. La microscopia a super-risoluzione a singola molecola (Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM) è una delle tecniche più avanzate per l'indagine cellulare a livello nanoscopico. Tuttavia, l'imaging di cellule intere con precisione a livello di singola molecola è complicato da problemi quali l'elevato sfondo di fluorescenza e la lentezza dei tempi di acquisizione, soprattutto quando si osservano più target in 3D.

soTILT3D: un'innovativa piattaforma di imaging

Per superare questi ostacoli, è stato sviluppato un nuovo approccio denominato soTILT3D, che combina diverse innovazioni per migliorare la precisione e la velocità di imaging. Questo sistema si basa sull'utilizzo di un fascio di luce inclinato (Light Sheet, LS) gestito da un singolo obiettivo ottico, che permette una migliore sezione ottica e riduce lo sfondo di fluorescenza. Inoltre, include un chip microfluidico nanostampato in grado di incorporare ottiche riflettenti, migliorando la capacità di scambio di soluzioni durante l'acquisizione senza compromettere la qualità dell'immagine.
Il soTILT3D integra inoltre l'ingegnerizzazione della funzione di diffusione del punto (Point Spread Function, PSF) e l'uso del deep learning per l'analisi dei segnali, garantendo un'acquisizione precisa delle immagini 3D delle molecole. Questa piattaforma è anche dotata di un sistema di stabilizzazione attiva per correggere eventuali movimenti e consentire l'imaging a lungo termine.

Tecniche utilizzate: Exchange-PAINT e Light Sheet inclinato

Un elemento fondamentale di questo sistema è l'utilizzo della tecnica Exchange-PAINT, che consente l'imaging sequenziale di più target senza errori cromatici. Questa tecnica si basa sull'uso di sonde oligonucleotidiche, che si legano in modo specifico ai target desiderati, riducendo l'errore tipico delle immagini multi-colorazione.
Il fascio di luce inclinato (Light Sheet) viene utilizzato per illuminare il campione, riducendo l'eccitazione fuori fuoco e il conseguente sfondo di fluorescenza. Questo approccio migliora significativamente la precisione di localizzazione delle singole molecole e consente una più veloce acquisizione delle immagini, soprattutto in campioni spessi come le cellule mammifere.

Vantaggi dell'innovazione

Il sistema soTILT3D risolve numerosi problemi associati ai metodi di microscopia a super-risoluzione precedenti. Ad esempio, l'uso di un obiettivo singolo ad alta apertura numerica (NA) per il fascio di luce inclinato consente un'elevata efficienza di raccolta dei fotoni senza problemi di deriva relativa o ostacoli fisici. Inoltre, la configurazione con un LS inclinato permette l'imaging fino al coprioggetti, senza la necessità di montature speciali per il campione.
L'uso del deep learning per l'analisi delle immagini consente la localizzazione di segnali che si sovrappongono, rendendo possibile l'acquisizione di immagini ad alta densità in 3D. Questo permette di ottenere un aumento della velocità di imaging, riducendo il tempo necessario per acquisire immagini di alta qualità.

Applicazioni del soTILT3D

La piattaforma soTILT3D è stata utilizzata per l'imaging di intere cellule con una risoluzione senza precedenti. Ad esempio, è stata utilizzata per l'imaging di proteine della lamina nucleare (lamin B1, lamin A/C, LAP2), mitocondri e proteine della membrana plasmatica come ezrin. Grazie all'elevata precisione di localizzazione e alla riduzione del rumore di fondo, è stato possibile determinare le distanze relative tra diverse proteine nucleari con una precisione di pochi nanometri.
Un altro esempio di applicazione è l'imaging di aggregati di cellule staminali utilizzando la tecnica dSTORM (Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy). In questi casi, l'illuminazione con fascio di luce inclinato ha permesso di migliorare il rapporto segnale-rumore fino a quattro volte rispetto ai metodi di illuminazione convenzionali.

Conclusioni: un futuro luminoso per la microscopia cellulare

Il sistema soTILT3D rappresenta un passo avanti significativo nel campo dell'imaging cellulare a super-risoluzione. Combinando l'uso di un fascio di luce inclinato, l'ingegnerizzazione della PSF, il deep learning e un sistema di stabilizzazione attiva, questa piattaforma consente l'imaging di intere cellule in 3D con una velocità e una precisione mai raggiunte prima.
Questo nuovo approccio apre la strada a una vasta gamma di applicazioni, dalla comprensione dei meccanismi molecolari nelle cellule sane alla ricerca sui processi patologici. La capacità di ottenere immagini di alta qualità e di correlare la posizione delle molecole con una precisione nanometrica rappresenta una risorsa inestimabile per la biologia cellulare e molecolare.
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